Современные методы терапевтического ангиогенеза (обзор литературы)

• Иванов А.Н.
• Чаббаров Ю.Р.

Резюме

Терапевтический ангиогенез - это направление лечения, основанное на стимулировании роста новых кровеносных сосудов для восполнения дефицита перфузии и вследствие этого восстановления функции пораженного органа. Терапевтический ангиогенез особенно актуален при неэффективности или невозможности хирургических способов восстановления перфузии ишемизированной ткани. Параллельно распространяется точка зрения, что данный метод может показать бόльшую эффективность на начальных стадиях ишемических процессов, в том числе для профилактики прогрессирования заболевания и развития осложнений.

Большинство технологий стимулирования ангиогенеза базируется на создании высокой концентрации ангиогенных факторов роста. Для этого могут применяться физические и химические методы, которые стимулируют выработку эндогенных проангиогенных молекул. Однако у многих больных есть дефекты в эндогенных механизмах регуляции ангиогенных процессов, поэтому основным направлением исследований является разработка методов полноценного протезирования механизмов регуляции ангиогенеза. В обзоре представлены данные о современных технологиях терапевтического ангиогенеза. Отдельно рассмотрено состояние развития групп методов, основанных на терапии рекомбинантными факторами роста, кодирующими генами, а также клетками и их производными. Изложены особенности, достоинства и ограничения каждого метода.

Ключевые слова:ангиогенез; терапевтический ангиогенез; терапия факторами роста; генная терапия; клеточная терапия; терапия стволовыми клетками; внеклеточные везикулы

Введение

В Российской Федерации болезни системы кровообращения являются основной причиной смерти. В структуре смертности от разных сердечно-сосудистых заболеваний на ишемическую болезнь сердца (ИБС) приходится до 70% [1]. Для лечения болезней системы кровообращения широко применяется фармакотерапия, посредством которой возможно замедлить прогрессирование заболевания, снизить выраженность симптомов и уменьшить риск возникновения осложнений. Из способов радикального лечения с убедительной доказательной базой доступны хирургический метод и аллотрансплантация пораженного органа. Эффективность трансплантации ограничена нехваткой доноров, высоким риском отторжения и необходимостью приема спектра препаратов (в том числе иммуносупрессивных) с множеством побочных эффектов [2, 3].

Среди хирургических тактик можно выделить 2 основные:

• имплантация сосудистых протезов, что по своей сути становится аналогом так называемого спрутинга - одного из механизмов ангиогенеза (sproutingangiogenesis) [2-4];
• установка стента - устранение стеноза сосуда, что является имитацией ангиогенеза путем расщепления сосуда (intussusceptive angiogenesis) [2-4].

Применение хирургических методов ограничено у пациентов с инфекционными заболеваниями, при выраженной коморбидности. При окклюзии артерий на протяженном участке оперативное вмешательство нередко оказывается неэффективным или приводит лишь к кратковременным улучшениям. В такой ситуации потенциальным методом лечения может оказаться терапевтический ангиогенез (ТА) [4].

ТА - это метод лечения ишемических заболеваний путем стимулирования образования новых кровеносных сосудов с помощью различных агентов. ТА позволяет полностью или частично восполнить дефект перфузии, запускать регенерацию и восстановление функциональной активности ишемизированной ткани [4]. В настоящее время ведется разработка полноценного протезирования механизмов регуляции ангиогенеза. Наиболее перспективными в этом направлении являются рекомбинантные белки, генная терапия, препараты, основанные на клетках и их производных. Данный обзор посвящен рассмотрению этих методов, их механизмов, преимуществ и ограничений.

Терапия рекомбинантными факторами роста

Метод основан на введении в ишемизированную ткань экзогенных ангиогенных факторов роста (АФР) путем однократной или разделенной на несколько сеансов внутриартериальной, внутривенной, локальной внутрисосудистой (интракоронарной) или внутритканевой инъекций. Существенной разницы между эффективностью различных способов введения не выявлено, если достигались равные концентрации в ткани [4]. При системном воздействии митогенная активность АФР ввиду их плюрипотентности может быть реализована в отдаленных тканях, поэтому местное применение считается более безопасным [5].

На моделях ИБС и заболеваний периферических артерий (ЗПА) оценивалась эффективность рекомбинантного VEGF (rhVEGF), rhFGF-2, rhAng-1, rhHGF для ТА [4]. Большая часть исследований свидетельствует об эффективном стимулировании ангиогенеза, что проявлялось в усиленном развитии коллатеральных сосудов, коррекции гемодинамического дефицита, восстановлении функционального состояния ишемизированной ткани. Эти результаты подтвердились в некоторых ранних клинических исследованиях (КИ), где было выявлено улучшение клинического статуса пациентов после введения rhFGF-2, rhFGF-1, rhVEGF-165 [6-8].

Отдельного рассмотрения заслуживает ТА, использующийся для заживления ран, поскольку в этом случае на результат влияет не только улучшение перфузии, но и прямое стимулирование роста грануляционной ткани и эпителизации. Показано, что наружное применение rhVEGF-121, rhVEGF-165, rhPlGF, rhPDGF, rhEGF, rhFGF-2 способствует ускоренному заживлению ран [9]. Особо эффективным оказался rhPDGF, поэтому в США для стимулирования раневого ангиогенеза был одобрен основанный на нем препарат бекаплермин (Becaplermin). Важнейшими механизмами действия данного лекарства являются активация ангиогенеза и усиление образования грануляционной ткани [10]. Бекаплермин способствует ускорению заживления при диабетических и венозных язвах и уменьшению частоты ампутаций у пациентов с тяжелыми нарушениями трофики нижних конечностей [11]. Эффективность бекаплермина оказалась ниже, чем ожидалось изначально, что вкупе с высокой стоимостью лечения (более 1000$ на одного пациента) привело к небольшому объему продаж.

GEM 21S, представляющий собой синтетический костный матрикс из β-трикальция фосфата, в который загружен PDGF, одобрен FDA для ускорения регенерации костных дефектов пародонта и стимулирования заживления ран десны [12]. Также до клинического применения допущены препараты, основанные на rhEGF: препараты непидермин (Nepidermin) и Regen-d 150 gel. Они обладают доказанной эффективностью для ускорения заживления диабетических язв и снижения риска ампутаций у пациентов с хроническими расстройствами кровоснабжения нижних конечностей на фоне сахарного диабета (СД) [9].

Клиническое применение рекомбинантных АФР сегодня ограничено, поскольку в ходе масштабных плацебо-контролируемых клинических исследований (КИ) было установлено, что использование этих препаратов для системного действия не дает стойкого удовлетворительного эффекта. В ходе КИ FIRST (ИБС) и TRAFFIC (ЗПА) было установлено, что терапия rhFGF-2 не способствует улучшению перфузии и клинического статуса на длительном промежутке времени [13, 14]. КИ VIVA показало, что терапия высокими дозами rhVEGF-165 может способствовать уменьшению класса стенокардии, но не влияет на перфузию миокарда и результаты тредмил-теста [15]. Были также предприняты попытки повысить эффективность с помощью одномоментного введения нескольких АФР, однако метод не показал высокой эффективности [16].

Таким образом, ТА применим только в форме препаратов с умеренной проангиогенной активностью для локального введения. Попытки системного введения АФР или использования более активных АФР не привели к значительному повышению эффективности ТА, а профиль безопасности оказался хуже. Следовательно, основное направление развития - применение этих препаратов для стимулирования ангиогенеза в неглубоко расположенных тканях (в частности, в ранах). Технологии стимулирования ангиогенеза и регенерации во внутренних органах эффективность не показали.

Причины и механизмы ограничений терапии рекомбинантным белком

Недостаточная эффективность данного вида лечения во многом связана с ростом аберрантных сосудов (с нарушенной проницаемостью, неравномерно расширенным просветом и извитой формой), образованием гемангиом [из-за слишком выраженного стимулирования пролиферации эндотелиальных клеток (ЭК)] и развитием незрелых сосудов [17]. Это связано с несоответствием локальной концентрации экзогенного АФР и длительности его действия физиологическим паттернам. У АФР очень узкий терапевтический диапазон, поэтому критически важно создать точную концентрацию в ткани [16]. При превышении концентрации формируются ангиомы и аберрантные сосуды, в составе которых выявляются гладкомышечные клетки патологического фенотипа, а количество перицитов намного ниже необходимого, что указывает на их незрелость [18]. Субнормальная концентрация запускает недостаточно интенсивный для восстановления перфузии ангиогенез, а сформированные сосуды не успевают созреть и быстро регрессируют после снижения содержания VEGF [19].

Было показано, что для выживания, стабилизации и созревания новообразованных сосудов необходимо поддержание высокой концентрации экзогенного АФР в течение примерно 4 нед [20]. На деле через 3 сут после инъекции rhFGF в миокарде сохранялось <0,1% изначальной концентрации при системном внутривенном введении, <0,1% - при локальном внутрикоронарном и около 2% - при внутримиокардиальном [21], т. е. длительности действия рекомбинантного белка не хватает для созревания сосудистой сети. В настоящее время разрабатываются методы преодоления данного ограничения. В частности, перспективный способ усиления локального эффекта основан на использовании АФР, которые прочно закрепляются во внеклеточном матриксе (ВКМ). Связывание АФР с ВКМ осуществляется посредством гепарин-связывающих доменов, которые прочно соединяются с протеогликанами гепарансульфата ВКМ [22]. Использование АФР с оптимальной силой связи с ВКМ может способствовать повышению эффективности ТА.

Превышение системной концентрации АФР ввиду резорбции или при системном введении может привести к побочным эффектам, которые бывают острыми и отсроченными [23]. Важным острым побочным эффектом VEGF и FGF является эндотелий-зависимое снижение артериального давления, создающее риск возникновения летальной гипотензии, что ограничивает дозировку и скорость введения [24]. Отсроченные побочные эффекты связаны со стимулированием пролиферации нецелевых клеток или с активацией ангиогенеза в нецелевых тканях (опухолевой) [13]. Антионкогенное действие ингибиторов ангиогенеза создает справедливые опасения о способности АФР стимулировать опухолевый рост [25]. Возможно, это произойдет только при достижении определенной концентрации. Для объективной оценки влияния АФР на онкогенез необходимо долгосрочное клиническое исследование, но его этическая составляющая является ограничивающим обстоятельством [4]. Пострегистрационное исследование установило, что среди пациентов, использовавших более 3 тюбиков геля бекаплермина, смертность была в 5,2 раза выше, чем у тех, кто его не получал [26]. Если увеличение смертности от данного препарата было бы установлено до регистрации для клинического использования, то, возможно, бекаплермин не получил бы одобрения Управления по санитарному контролю за качеством пищевых продуктов, лекарственных препаратов и косметических средств США (FDA).

Важная причина несоответствия клинических результатов доклиническим кроется в дизайне исследований. В доклинических исследованиях использовались молодые и полностью здоровые животные, у которых создавали острую ишемию. Выраженность создаваемой ишемии была различной в зависимости от модели и могла быть меньше, чем у человека с ЗПА [27]. У людей же нарушения кровотока возникают постепенно на фоне атеросклероза, СД и сопровождается эндотелиальной дисфункцией и возрастными изменениями. Эффективность местных инъекций VEGF старым животным была сопоставима с результатами в группе молодых, получавших плацебо, что говорит о возрастных ограничениях в терапевтическом ангиогенезе [28]. АФР способствуют восстановлению перфузии посредством не только стимулирования ангиогенеза, но и других механизмов. Вазодилатация, развивающаяся в ответ на введение VEGF и FGF, может вызывать улучшения в контрольных точках доклинических исследований, но быть бесполезной и даже опасной в клинической практике [4].

Участники КИ нередко получали препараты с антиангиогенным эффектом (аторвастатин, ацетилсалициловая кислота и др.) в рамках стандартных схем лечения ишемических заболеваний [29]. В большинстве КИ участвовали пациенты, у которых невозможна или безуспешна хирургическая реперфузия ввиду крайне низких компенсаторных способностей сосудистой системы, что изначально подразумевает околонулевые шансы на успех лечения. Возможно, ТА окажется эффективным у пациентов с более ранними стадиями ишемического заболевания, но эта гипотеза требует проверки в ходе КИ.

Таким образом, на данный момент ведутся разработки методов преодоления существующих ограничений, но к значительному повышению эффективности терапии рекомбинантными АФР они не привели. Вместе с тем данных о побочных эффектах АФР становится все больше, что оказывает негативное влияние на перспективы клинического использования данного метода.

Генная терапия

Поскольку одним из ограничений терапии рекомбинантными АФР является недостаточная длительность поддержания их высокой локальной концентрации, исследователи сфокусировались на введении кодирующего АФР гена, что должно было способствовать длительной экспрессии проангиогенных молекул. Для доставки гена может использоваться невирусная система (плазмидная ДНК) или вирусные векторы [19, 30]. Большое распространение получили аденовирусные векторы, потому что они, как и невирусные системы, не встраиваются в геном, а находятся в виде внехромосомной ДНК и доставляемые ими гены экспрессируются с участием клеточных ферментов [31, 32]. Основное преимущество плазмид - их безопасность, обусловленная низкой иммуногенностью, а недостаток - невысокая эффективность трансфекции ввиду медленного проникновения сквозь фосфолипидные мембраны клеток (из-за большой молекулярной массы и отрицательного заряда). Для преодоления этого ограничения плазмиду вводят в составе липофильных комплексов или применяют некоторые физические методы, но их эффективность сомнительна [31, 32]. Доставку плазмидной ДНК чаще осуществляют путем локальных инъекций, потому что в кровотоке плазмиды подвергаются деградации под действием эндогенных нуклеаз [30, 33]. Вирусные векторы обеспечивают более эффективную трансдукцию и повышенную длительность экспрессии белка, но их иммуногенность снижает безопасность и ограничивает повторное введение (которое активно применяется в случае плазмид) [30].

В ходе доклинических исследований была установлена эффективность ТА с помощью плазмид для доставки генов: plVEGF-121, plVEGF-165, plVEGF-189, plHGF, plFGF-2, plPDGF-BB [34]. Результаты КИ оказались лучше, чем в случае с рекомбинантными белками, и генная терапия позволила расширить спектр применения ТА в клинической практике. Особое внимание ТА с помощью plVEGF было уделено российскими учеными. Положительный опыт ранних исследований привел к оценке эффективности и безопасности препарата Неоваскулген^®, действующим веществом которого является plVEGF-165 (IIb-III фазы) [35]. В ходе исследования было установлено, что двукратное внутримышечное введение данного препарата пациентам с хронической ишемией нижних конечностей (ХИНК) способствует уменьшению выраженности симптомов заболевания и увеличению дистанции безболевой ходьбы, лодыжечно-плечевого индекса, TcPO₂. В контрольной группе положительной динамики по данным показателям выявлено не было. На основании результатов этого исследования Неоваскулген^® был одобрен в 2011 г. в Российской Федерации для лечения ХИНК. В постмаркетинговом исследовании [35] эффективность препарата подтвердилась.

В КИ оценивали эффективность внутримышечных инъекций (дни 0 и 28) plHGF для лечения ЗПА. У пациентов уменьшалась боль в покое, улучшилось качество жизни и ускорялось заживление язв в случае их наличия [36]. Согласно исследованию R.J. Powell et al., терапия plHGF у пациентов с ЗПА способствовала улучшению перфузии ткани, уменьшению боли и ускорению заживления язв без влияния на число ампутаций и смертность [37]. В результате в 2019 г. в Японии для лечения ХИНК был одобрен препарат Collategene, основанный на plHGF [38].

Таким образом, доклинические данные не всегда подтверждались в ходе КИ, хотя некоторые препараты все же были одобрены для клинического применения. Вместе с тем следует отметить, что представленные данные косвенно указывают на неодинаковую эффективность препаратов в разных группах больных. В пользу этого свидетельствует положительное влияние введения кодирующих АФР генов на функциональные параметры, но не улучшение прогноза пациента (выживаемость и вероятность ампутации). Для более точного определения показаний к ТА требуются детальные исследования в различных группах больных.

Причины и механизмы ограничений генной терапии

При проведении генной терапии по сравнению с введением рекомбинантного белка высвобождение было не взрывное, а более плавное, и терапевтическая концентрация сохранялась дольше. Но этого оказалось недостаточно. Интенсивная экспрессия поддерживалась лишь в течение 5-10 дней ввиду индуцирования воспалительной реакции, вследствие которой иммунные механизмы очищали клетки от поступивших извне генов [32]. Другая проблема заключается в недостижимости достаточно тонкого контроля над локальной концентрацией АФР. Невозможно достоверно определить, какое количество вносимого генетического материала будет поглощено клетками, какой окажется интенсивность экспрессии и будет ли она однородной [20, 39]. Поэтому существует риск превышения системной концентрации АФР, что может привести к известным побочным эффектам: гипотензии и стимулированию пролиферации клеток в нецелевых тканях. Хотя связывание вектора с клеткой осуществляется с некоторой варьирующей специфичностью, точное нацеливание на определенные клетки-мишени все еще недостижимо [26]. После переноса генетического материала никакие дальнейшие манипуляции невозможны, а контроль посредством изменения дозы вводимого вектора не дает достаточно тонкой регуляции локальной концентрации АФР. Также нужно помнить, что избыточное увеличение доз генного препарата повышает риск токсического эффекта [20, 31, 39]. Несмотря на многочисленные приведенные выше предостережения, оценка безопасности генной терапии не выявила существенного риска при соблюдении концентраций. Таким образом, генная терапия имеет потенциал, но необходимо разрабатывать способы доставки для достижения необходимого стабильного уровня экспрессии на достаточно длительном промежутке времени.

Терапия аутогенными и аллогенными клетками и их производными

Суть данного метода заключается в использовании клеток или изготовляемых из них препаратов для стимулирования ангиогенеза. Особое место занимает терапия тромбоцитарными препаратами, среди которых выделяют PRP, тромбоцитарный концентрат, богатый тромбоцитами фибрин, тромбоцитарный гель. Принцип их действия основывается на высвобождении из тромбоцитов набора биологически активных молекул, стимулирующих ангиогенез и регенерацию тканей. Эти вещества высвобождаются из тромбоцитов либо при их целенаправленном разрушении в процессе изготовления препарата, либо при их лизисе после введения в ткань и гибели. Наибольшее распространение получила PRP-терапия, основанная на локальном применении обогащенной тромбоцитами плазмы (platelet-richplasma) для стимулирования регенерации тканей. PRP - это плазма, содержащая тромбоциты в концентрации, превышающей таковую в периферической крови. К преимуществам метода относят невысокую стоимость, простоту, безопасность и физиологичность, поскольку PRP воспроизводит естественный каскад тканевых процессов. Применение PRP может быть полезным для стимулирования заживления ран (хронических и острых), регенерации костной и мягких тканей опорно-двигательного аппарата [40]. В реализации регенераторного эффекта PRP важную роль играет стимулирование ангиогенеза за счет содержания большого количества АФР (VEGF, PDGF, IGF-1, TGF, EGF, FGF) и цитокинов [41]. Использование систем таргетной доставки и контролируемого релиза в PRP-терапии позволяет оптимизировать кинетику и улучшить результат лечения [42]. Похожим методом является использование для стимулирования регенерации и ангиогенеза экстракта жировой ткани, который содержит многочисленные АФР и цитокины, экспрессируемые адипоцитами [43].

Введение в зону ишемии аутогенных стволовых клеток представляет углубленный подход с аналогичным PRP-терапии принципом, поскольку основной механизм терапевтического действия клеток - паракринный базируется на секреции проангиогенных молекул. Клетки-предшественницы могут дифференцироваться в тканеспецифические элементы и восполнять морфологические дефекты (давать начало ЭК, которые участвуют в формировании сосудов), оказывать противовоспалительное, антиапоптотическое, противофибротическое и иммуномодулирующее действие. Наибольший интерес для ТА представляют эндотелиальные клетки-предшественницы (ЭКП), индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК), мононуклеарные клетки-предшественницы (МНК), мезенхимальные стволовые клетки (МСК) и стволовые клетки жировой ткани (СКЖ) [44].

ИПСК получают из дифференцированных соматических клеток путем внесения в них генов, экспрессия которых индуцирует их плюрипотентность. Источники ИПСК доступны и удобны для забора (фибробласты кожи). ИПСК могут дифференцироваться почти в любой тип взрослых клеток и секретировать широкий спектр сигнальных молекул, что определяет их большой потенциал в регенеративной медицине и для ТА. Но полноценная реализация данных преимуществ в клинической практике на сегодняшний день затруднена, поскольку плюрипотентность ИПСК создает риск канцерогенеза, особенно образования тератом. Поэтому крупномасштабных КИ, в которых ИПСК показали бы многообещающие результаты, на данный момент все еще нет, но методы преодоления вышеуказанных ограничений активно разрабатываются [45].

ЭКП - это клетки, способные дифференцироваться в зрелые ЭК и участвующие в формировании сосудов. Изначально предполагалось, что ЭКП происходят из красного костного мозга (ККМ), откуда при появлении стимула [ишемия, экзогенное введение гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ), VEGF, эстрогена] они мобилизуются и с током крови направляются в ишемизированную ткань. На данный момент обсуждается возможность формирования ЭКП в стенке сосудов крупного и мелкого калибра, хотя доподлинно это не установлено [46]. Для идентификации ЭКП наиболее часто в актуальных исследованиях используется фенотип CD34⁺, CD133⁺, VEGR-2⁺ [47].

МНК представляют собой концентрат аспирата ККМ: лимфоциты, нейтрофилы, моноциты и около 1% стволовых клеток (гемопоэтические, МСК, ЭКП) [48].

МСК способны дифференцироваться в хондробласты, остеобласты и адипоциты. МСК секретируют VEGF, PDGF, HGF, FGF, IGF-1, G-CSF, Ang-2, интерлейкины и хемокины, оказывают противовоспалительное, антиапоптотическое и противофибротическое действие [49]. Несмотря на присутствие МСК во многих тканях, чаще всего их выделяют из ККМ и жировой ткани, реже используют пуповину и плаценту [50]. ККМ является удобным для доступа возобновляемым источником, но концентрация МСК в нем невысока, а сама процедура забора биоматериала болезненна и травматична. Жировая ткань представлена в большом количестве, в ней высокое содержание стволовых клеток даже у пожилых пациентов, а процесс ее забора (липосакция) - простой, малоинвазивный и недорогой [51]. При этом эффективность МСК, полученных из жировой ткани и из ККМ, для ТА сопоставима, а профиль безопасности одинаково хорош [50].

МСК, полученные из жировой ткани, нередко обозначаются термином СКЖ (также их называют регенеративными клетками жировой ткани). СКЖ усиливают ангиогенез посредством секреции VEGF, TGF-β, HGF и дифференцировки в перициты [51, 52]. Ввиду трудности однозначной идентификации каждого вида клеток СКЖ может состоять из разных клеточных линий. Типичный состав включает МСК, ЭКП, ГМК и лейкоциты [53].

Интрамиокардиальная аутотрансплантация CD34⁺-клеток пациентам с рефрактерной стенокардией способствует уменьшению частоты приступов, увеличению толерантности к физической нагрузке и снижению риска смерти [54]. В КИ II/III фазы на промежутке в 18 мес оценивалась эффективность интрамиокардиальной аутотрансплантации CD133⁺-клеток и МНК в периинфарктные области [55]. Введение и CD133⁺-клеток, и МНК хорошо переносилось и было безопасным. Фракция выброса левого желудочка увеличилась на 9% в группе CD133⁺-клеток и на 7% в группе МНК. Размеры нежизнеспособных участков миокарда уменьшились на 75% в группе CD133⁺, но остались неизменными в группе МНК. Уменьшение систолического утолщения стенки было одинаковым в обеих группах. Терапевтический потенциал CD34⁺- и CD133⁺-клеток высок, но необходимо проведение дальнейших КИ с дизайном, направленным на минимизацию риска систематической ошибки и оценку наиболее значимых для клинической практики критериев.

Сравнение эффективности МНК и МСК для лечения пациентов с ЗПА и СД 2-го типа показало, что в группе МСК были выше скорость и частота заживления язв, более выражены улучшения лодыжечно-плечевого индекса и TcPO₂, а формирующаяся сосудистая сеть плотнее [56]. Аналогично трансплантация МСК оказалась эффективнее МНК при ИБС: спустя год после лечения в группе МСК увеличилась дистанция 6-минутной ходьбы, улучшилась регионарная функция миокарда и уменьшился размер некроза. В группе МНК, как и в группе плацебо, изменений выявлено не было. В КИ I/II фазы сравнивалась эффективность локальной доставки аутологичных МНК и МСК для лечения пациентов с ишемической кардиомиопатией [57]. Через 1 год качество жизни (MLHF) улучшилось в группах МНК и МСК, но не плацебо; расстояние 6-минутной ходьбы увеличилось в группе МСК; размер инфаркта уменьшился в группе МСК; регионарная функция миокарда также улучшилась в группе МСК; частота нежелательных явлений была сопоставима. Таким образом, аутотрансплантация МСК - эффективный и безопасный метод, требующий дальнейшего изучения и обладающий потенциалом клинического применения. Что касается МНК, несмотря на их способность стимулировать ангиогенез, улучшать перфузию и функцию ишемизированной ткани, по результатам приведенных выше сравнительных исследований они оказались менее эффективными, чем другие клетки-предшественницы [58].

В КИ II фазы продемонстрирована осуществимость и безопасность трансплантации СКЖ пациентам с ЗПА [59]. Спустя 6 мес средний размер язвы уменьшился в 3 раза, проходимое за 6 мин расстояние значительно возросло, а качество жизни существенно улучшилось. Частота ампутаций составила 5,9% при 100% выживаемости, что указывает на большой терапевтический потенциал СКЖ. Например, после трансплантации МНК 19% пациентов подверглись ампутации, а выживаемость составила 95% [60]. Эффективность СКЖ подтверждается значительным увеличением количества перфузируемых сосудов. Трансплантация аутологичных СКЖ пациентам с ИБС приводила к улучшению перфузии миокарда и качества жизни (по MLFHQ) по сравнению с группой плацебо [61]. Необходимо провести исследование III фазы, поскольку на СКЖ возлагаются большие надежды.

Аутотрансплантация связана с минимальным риском иммунных реакций отторжения, но ее применение ограничено, потому что наличие показаний к ней подразумевает длительный активный патологический процесс, который может снижать эффективность собственных стволовых клеток [62]. У пожилых и курящих пациентов, у имеющих сопутствующие заболевания [СД, хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ), артериальная гипертензия, атеросклероз] снижено количество и активность собственных клеток-предшественниц [63, 64]. Одним из решений этой проблемы является трансплантация аллогенных клеток - истинная клеточная терапия. МНК, CD133⁺- и CD34⁺-клетки активно экспрессируют главный комплекс гистосовместимости (major histocompatibility complex, MHC) II типа, который может индуцировать иммунный ответ и отторжение, что накладывает ограничения на аллотрансплантацию и усложняет подбор донора стволовых клеток. Этот недостаток не присущ МСК, поскольку они характеризуются низкой экспрессией MHC II типа и оказывают иммуносупрессивное действие [65]. МСК также удобны в обращении: их нетрудно выделить, они быстро размножаются invitro и обладают, как было доказано выше, удовлетворительным терапевтическим потенциалом [50].

Эффективность внутривенного введения аллогенных МСК, полученных из ККМ, пациентам с недавно перенесенным ИМ была оценена в исследовании J.M. Hare et al. [66]. В группе лечения МСК была отмечена тенденция к повышению фракции выброса левого желудочка, обратному ремоделированию миокарда и улучшению субъективной оценки общего состояния по сравнению с группой плацебо. Эффективны и МСК, полученные из пуповины: внутривенная доставка пациентам с хронической сердечной недостаточностью способствовала увеличению фракции выброса левого желудочка, улучшению качества жизни (Миннесотский опросник) и уменьшению функционального класса (NYHA) [67].

В многочисленных обзорах исследователи суммируют данные КИ терапии ишемических заболеваний с помощью аллогенных МСК и делают вывод о безопасности, эффективности и осуществимости данного метода [68, 69]. Результаты варьируют в зависимости от источника МСК, технологий их подготовки к имплантации, способа введения, дозировки и общеклинического статуса пациента. А по причине того, что эти параметры в большинстве КИ различаются, их результаты трудно обобщать или сравнивать, хотя это необходимо для объективной оценки эффективности клеточной терапии. Для клинического использования нужен точно охарактеризованный продукт с отработанным способом получения и культивирования клеток, чтобы на выходе качественные и количественные свойства препарата были стандартизированы, а эффект всесторонне изучен и предсказуем. Это относится не только к МСК, но и к другим типам стволовых клеток. Необходимы масштабные КИ для упорядочивания, систематизации и проверки клинических данных, выявления лучших способов получения, идентификации и культивирования клеток, но текущее разнообразие методов и дороговизна исследований осложняют ситуацию.

Таким образом, трансплантированные клетки представляют собой депо проангиогенных молекул с динамической регуляцией, которая возможна за счет обратной связи с организмом. Клетки чувствительны к условиям среды: ишемия усиливает их проангиогенную активность, а при восстановлении перфузии они не оказывают избыточного стимулирующего действия. Поэтому клетки обеспечивают оптимальную кинетику высвобождения АФР, чего не удалось достичь при введении рекомбинантных белков или кодирующих их генов.

За последние годы существенно возрос интерес к внеклеточным везикулам (ВВ) как к терапевтическому агенту, поскольку было установлено, что они вносят определяющий вклад в реализацию проангиогенного эффекта клеток, но обладают рядом преимуществ перед ними [70]. ВВ более стабильны и обладают низкой иммуногенностью и онкогенностью, поэтому безопаснее клеток. ВВ сохраняют преимущества клеток ввиду содержания широкого спектра активных молекул, которые воздействуют на все звенья ангиогенеза и имеют оптимальную кинетику высвобождения [70]. В состав ВВ входит около 1200 видов различных молекул, среди которых представлены белки (сигнальные и структурные), липиды (формируют мембрану ВВ) и нуклеиновые кислоты: ДНК (состав и функции изучены недостаточно), мРНК и некодирующая РНК [71].

На данный момент для лечения ишемических заболеваний наибольший интерес представляют ВВ, полученные от МСК. В ответ на гипоксию МСК высвобождают ВВ, содержащие АФР, мРНК, транскрипционные факторы STAT3, NF-κB и белки Wnt, которые повышают активность транскрипции генов АФР в ЭК. ВВ МСК содержат микроРНК-31, дезактивирующую ингибитор HIF-1α, и микроРНК-29а, нарушающий экспрессию гена VASH1 [71]. Интрамиокардиальное введение ВВ МСК мышам с моделью ИМ способствует активации ангиогенеза и формированию более плотной по сравнению с группой контроля капиллярной сети [72]. Трансфекция МСК геном HIF-1α приводит к повышению интенсивности секреции ВВ, увеличению содержания в них проангиогенных белков, микроРНК и особенно Jagged1 - лиганда Notch, участвующего в регуляции ангиогенеза. Как результат, ВВ, являющиеся производными сверхэкспрессирующих HIF-1α МСК, оказывают более интенсивный проангиогенный эффект, чем ВВ нетрансфицированных МСК [73].

Исследования эффективности терапии с помощью ВВ находятся на довольно ранней стадии, но направление быстро развивается. Эффективность лечения зависит от правильного подбора клеток-источников, создания необходимых условий их культивирования, определения наиболее эффективных методов выделения, очистки и модификации ВВ. С одной стороны, это увеличивает длительность, сложность, наукоемкость и стоимость работы с ВВ, а с другой - создает огромный потенциал регулирования их состава и свойств. Для реализации всех преимуществ ВВ необходима оптимизация методов работы с ними, поскольку известные на сегодняшний день до́роги и сложны. Различия между некоторыми группами ВВ могут быть столь тонкими, что вкупе с их большим разнообразием и недостаточной изученностью специфичных для каждого типа ВВ маркеров затрудняется получение чистого препарата, в котором содержался бы только один тип необходимый ВВ [74].

Причины и механизмы ограничений цитотерапии и способы их преодоления

При терапии клетками-предшественницами необходимо учитывать, что на их дифференцировку влияют условия среды (наличие гипоксии и различных биохимических агентов), поэтому фенотип может меняться в динамике, и паттерн этих изменений не поддается точному прогнозированию [49]. Следствием этого является невозможность получения одинаковых фенотипов клеток даже при культивировании в стандартизированных искусственных средах. Тем более непредсказуемыми будут свойства клеток после трансплантации, поскольку условия внутренней среды каждого организма варьируют в широких пределах и непостоянны во времени [49].

Для любого вида клеточной терапии характерны 3 важных ограничения: во-первых, риски по безопасности, связанные с иммуногенностью и онкогенностью клеток. Во-вторых, невысокая приживляемость, которая связана с гипоксией и недостатком питательных веществ в ишемизированной ткани, с активным процессом воспаления и повышенной концентрацией проапоптотических цитокинов [75]. В-третьих, невысокая способность к самонаведению при системном введении приводит к необходимости локальной доставки клеток в целевую ткань, что может быть травматичным, особенно при интрамиокардиальных инъекциях [68].

Повысить выживаемость клеток можно с помощью систем, обеспечивающих адресную доставку клеток и их контролируемый релиз, или с помощью различных методов модификации клеток, к которым относят предварительное кондиционирование (обработку клеток при определенных условиях среды), генную модификацию, совместное введение с другими активными компонентами. Для повышения устойчивости клеток к ишемии осуществляется их гипоксическое прекондиционирование (помещение в среду с концентрацией кислорода, равной 0-5% на сроке около 3-24 ч), которое приводит к активации сигнальных путей адаптации и повышению выживаемости [76]. Прекондиционированные клетки эффективнее стимулируют ангиогенез. Так, в группе животных, которым вводили прекондиционированные МСК, перфузия оказалась выше, чем в группе МСК без аналогичной обработки. Прекондиционированные МСК более активно секретировали HIF-1α и АФР; они проявляли бо́льшую интенсивность пролиферации, миграции и дифференцировки в ЭК. Культивирование клеток в среде, лишенной стандартного энергетического субстрата (голодание), также может способствовать повышению их выживаемости без нарушения проангиогенной функции [77].

Другим методом улучшения свойств клеток является их генная модификация. Для реализации такого подхода в клетки вносят ДНК, кодирующую АФР. При выборе системы доставки гена необходимо считаться с тем фактом, что присутствие вируса в подлежащей трансплантации клетке создает риск мутагенеза и индукции иммунного ответа, поэтому приоритетно использование плазмид. Доставленный в клетку ген экспрессируется на стабильном уровне в течение срока до 10 мес, что соответствует физиологическому паттерну высвобождения АФР [78]. На крысиной модели ИМ было показано, что трансплантация модифицированных геном VEGF МСК способствует формированию более плотной сосудистой сети и более выраженному восстановлению функции миокарда по сравнению с введением только МСК или только AdVEGF [79].

ВВ не имеют ограничений по приживляемости, онкогенности и иммуногенности, однако остальные ограничения аналогичны таковым для клеток. Также при доставке ВВ в свободном виде, особенно системном введении, они довольно быстро выводятся из организма, поэтому необходимо обеспечить достаточную длительность поступления или высвобождения ВВ. Этого можно достичь путем доставки ВВ с помощью тканеинженерных конструкций, которые дают типичные преимущества: контроль над профилем высвобождения, защиту от деградации и возможность локализовать действие ВВ [80].

Заключение

Терапевтический ангиогенез является перспективным, но все еще не получившим широкого клинического распространения методом лечения пациентов с ишемическими поражениями органов и тканей. Стимулирование ангиогенеза может стать основой принципиально нового подхода к лечению ишемических заболеваний и позволит улучшить качество и прогноз жизни у таких пациентов. В настоящее время разработано несколько технологий проведения терапевтического ангиогенеза, которые основаны на доставке в ишемизированную ткань рекомбинантных АФР, кодирующих их генов, а также клеток и их производных.

Литература

1. Косолапов В.П., Ярмонова М.В. Анализ высокой сердечно-сосудистой заболеваемости и смертности взрослого населения как медико-социальной проблемы и поиск путей ее решения. Уральский медицинский журнал. 2021; 20 (1): 58-64. DOI: https://doi.org/10.52420/2071-5943-2021-20-1-58-64

2. Fihn S.D., Gardin J.M., Abrams J., et al. 2012 ACCF/AHA/ACP/AATS/PCNA/SCAI/STS Guideline for the Diagnosis and Management of Patients With Stable Ischemic Heart Disease. Journal of the American College of Cardiology. 2012; 60: e44-e164. DOI: https://doi.org/10.1016/j.jacc.2012.07.013

3. Conte M.S., Bradbury A.W., Kolh P., et al. Global vascular guidelines on the management of chronic limb-threatening ischemia. Journal of Vascular Surgery. 2019; 69 (6S): 3S-125S.e40. DOI: https://doi.org/10.1016/j.jvs.2019.02.016

4. Tien J. Tissue Engineering of the Microvasculature. Comprehensive Physiology. 2019; 9 (3): 1155-1212. DOI: https://doi.org/10.1002/cphy.c180037

5. Edelman E.R., Nugent M.A., Smith L.T., Karnovsky M.J. Basic fibroblast growth factor enhances the coupling of intimal hyperplasia and proliferation of vasa vasorum in injured rat arteries. Journal of Clinical Investigation. 1992; 89 (2): 465-473. DOI: https://doi.org/10.1172/JCI115607

6. Laham R.J., Chronos N.A., Pike M., et al. Intracoronary basic fibroblast growth factor (FGF-2) in patients with severe ischemic heart disease: results of a phase I open-label dose escalation study. Journal of the American College of Cardiology. 2000; 36 (7): 2132-2139. DOI: https://doi.org/10.1016/s0735-1097(00)00988-8

7. Schumacher B., Pecher P., von Specht B.U., Stegmann T. Induction of neoangiogenesis in ischemic myocardium by human growth factors: first clinical results of a new treatment of coronary heart disease. Circulation. 1998; 97 (7): 645-650. DOI: https://doi.org/10.1161/01.cir.97.7.645

8. Hendel R.C., Henry T.D., Rocha-Singh K., et al. Effect of Intracoronary Recombinant Human Vascular Endothelial Growth Factor on Myocardial Perfusion: Evidence for a Dose-Dependent Effect. Circulation. 2000; 101 (2): 118-121. DOI: https://doi.org/10.1161/01.CIR.101.2.118

9. Veith A.P., Henderson K., Spencer A., et al. Therapeutic strategies for enhancing angiogenesis in wound healing. Advanced Drug Delivery Reviews. 2019; 146: 97-125. DOI: https://doi.org/10.1016/j.addr.2018.09.010

10. United States Food and Drug Administration, Product Description Regranex, Accessed 3/16/2018.

11. Papanas N., Maltezos E. Becaplermin gel in the treatment of diabetic neuropathic foot ulcers. Clinical Interventions in Aging. 2008; 3 (2): 233-240. DOI: https://doi.org/10.2147/cia.s1106

12. Singh P., Suresh D.K. Clinical evaluation of GEM 21S(®) and a collagen membrane with a coronally advanced flap as a root coverage procedure in the treatment of gingival recession defects: A comparative study. Journal of Indian Society of Periodontology. 2012; 16 (4): 577-583. DOI: https://doi.org/10.4103/0972-124X.106919

13. Lederman R.J., Mendelsohn F.O., Anderson R.D., et al. Therapeutic angiogenesis with recombinant fibroblast growth factor-2 for intermittent claudication (the TRAFFIC study): a randomised trial. Lancet. 2022; 359 (9323): 2053-2058. DOI: https://doi.org/10.1016/S0140-6736(02)08937-7

14. Simons M., Annex B.H., Laham R.J., et al. Pharmacological treatment of coronary artery disease with recombinant fibroblast growth factor-2: double-blind, randomized, controlled clinical trial. Circulation. 2002; 105 (7): 788-793. DOI: https://doi.org/10.1161/hc0802.104407

15. Jørgensen K.J., Johansson M. Drawing conclusions from the VIVA trial. Lancet. 2018; 391 (10133): 1894. DOI: https://doi.org/10.1016/S0140-6736(18)30786-4

16. Ucuzian A.A., Gassman A.A., East A.T., Greisler H.P. Molecular Mediators of Angiogenesis. Journal of Burn Care & Research. 2010; 31 (1): 158-175. DOI: https://doi.org/10.1097/BCR.0b013e3181c7ed82

17. Springer M.L., Chen A.S., Kraft P.E., et al. VEGF gene delivery to muscle: potential role for vasculogenesis in adults. Molecular Cell. 1998; 2 (5): 549-558. DOI: https://doi.org/10.1016/s1097-2765(00)80154-9

18. Lee R.J., Springer M.L., Blanco-Bose W.E., et al. VEGF gene delivery to myocardium: deleterious effects of unregulated expression. Circulation. 2000; 102 (8): 898-901. DOI: https://doi.org/10.1161/01.cir.102.8.898

19. Gianni-Barrera R., Burger M., Wolff T., et al. Long-term safety and stability of angiogenesis induced by balanced single-vector co-expression of PDGF-BB and VEGF164 in skeletal muscle. Scientific Reports. 2016; 6: 21546. DOI: https://doi.org/10.1038/srep21546

20. Ozawa C.R., Banfi A., Glazer N.L., et al. Microenvironmental VEGF concentration, not total dose, determines a threshold between normal and aberrant angiogenesis. Journal of Clinical Investigation. 2004; 113 (4): 516-527. DOI: https://doi.org/10.1172/JCI18420

21. Sakakibara Y., Tambara K., Sakaguchi G., et al. Toward surgical angiogenesis using slow-released basic fibroblast growth factor. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 2003; 24 (1): 105-111; discussion 112. DOI: https://doi.org/10.1016/s1010-7940(03)00159-3

22. Kant R.J., Coulombe K.L.K. Integrated approaches to spatiotemporally directing angiogenesis in host and engineered tissues. Acta Biomaterialia. 2018; 69: 42-62. DOI: https://doi.org/10.1016/j.actbio.2018.01.017

23. Ehrbar M., Zeisberger S.M., Raeber G.P., et al. The role of actively released fibrin-conjugated VEGF for VEGF receptor 2 gene activation and the enhancement of angiogenesis. Biomaterials. 2008; 29 (11): 1720-1729. DOI: https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2007.12.002

24. Ku D.D., Zaleski J.K., Liu S., Brock T.A. Vascular endothelial growth factor induces EDRF-dependent relaxation in coronary arteries. American Journal of Physiology. 1993; 265 (2 Pt 2): H586-592. DOI: https://doi.org/10.1152/ajpheart.1993.265.2.H586

25. Bodnar R.J. Epidermal Growth Factor and Epidermal Growth Factor Receptor: The Yin and Yang in the Treatment of Cutaneous Wounds and Cancer. Advances in Wound Care (New Rochelle). 2013; 2 (1): 24-29. DOI: https://doi.org/10.1089/wound.2011.0326

26. Young L.S., Searle P.F., Onion D., Mautner V. Viral gene therapy strategies: from basic science to clinical application. Journal of Pathology. 2006; 208 (2): 299-318. https://doi.org/10.1002/path.1896

27. Shimatani K., Sato H., Saito A., et al. A novel model of chronic limb ischemia to therapeutically evaluate the angiogenic effects of drug candidates. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 2021; 320 (3): H1124-H1135. DOI: https://doi.org/10.1152/ajpheart.00470.2020

28. Rivard A., Fabre J.E., Silver M., et al. Age-dependent impairment of angiogenesis. Circulation. 1999; 99 (1): 111-120. DOI: https://doi.org/10.1161/01.cir.99.1.111

29. Sabra M., Karbasiafshar C., Aboulgheit A., et al. Clinical Application of Novel Therapies for Coronary Angiogenesis: Overview, Challenges, and Prospects. International Journal of Molecular Sciences. 2021; 22 (7): 3722. DOI: https://doi.org/10.3390/ijms22073722

30. Hedman M., Hartikainen J., Syvänne M., et al. Safety and feasibility of catheter-based local intracoronary vascular endothelial growth factor gene transfer in the prevention of postangioplasty and in-stent restenosis and in the treatment of chronic myocardial ischemia: phase II results of the Kuopio Angiogenesis Trial (KAT). Circulation. 2003; 107 (21): 2677-2683. DOI: https://doi.org/10.1161/01.CIR.0000070540.80780.92

31. Melillo G., Scoccianti M., Kovesdi I., et al. Gene therapy for collateral vessel development. Cardiovascular Research. 1997; 35 (3): 480-489. DOI: https://doi.org/10.1016/s0008-6363(97)00167-3

32. Kaufmann K.B., Büning H., Galy A., et al. Gene therapy on the move. EMBO Molecular Medicine. 2013; 5 (11): 1642-1661. DOI: https://doi.org/10.1002/emmm.201202287

33. Losordo D.W., Vale P.R., Hendel R.C., et al. Phase 1/2 placebo-controlled, double-blind, dose-escalating trial of myocardial vascular endothelial growth factor 2 gene transfer by catheter delivery in patients with chronic myocardial ischemia. Circulation. 2002; 105 (17): 2012-2018. DOI: https://doi.org/10.1161/01.cir.0000015982.70785.b7

34. Lavu M., Gundewar S., Lefer D.J. Gene therapy for ischemic heart disease. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 2011; 50 (5): 742-750. DOI: https://doi.org/10.1016/j.yjmcc.2010.06.007

35. Deev R., Plaksa I., Bozo I., Isaev A. Results of an International Postmarketing Surveillance Study of pl-VEGF165 Safety and Efficacy in 210 Patients with Peripheral Arterial Disease. American Journal of Cardiovascular Drugs. 2017; 17 (3): 235-242. DOI: https://doi.org/10.1007/s40256-016-0210-3

36. Shigematsu H., Yasuda K., Iwai T., et al. Randomized, double-blind, placebo-controlled clinical trial of hepatocyte growth factor plasmid for critical limb ischemia. Gene Therapy. 2010; 17 (9): 1152-1161. DOI: https://doi.org/10.1038/gt.2010.51

37. Powell R.J., Goodney P., Mendelsohn F.O., et al. Safety and efficacy of patient specific intramuscular injection of HGF plasmid gene therapy on limb perfusion and wound healing in patients with ischemic lower extremity ulceration: results of the HGF-0205 trial. Journal of Vascular Surgery. 2010; 52 (6): 1525-1530. DOI: https://doi.org/10.1016/j.jvs.2010.07.044

38. Komatsuno T. The First Gene Therapy Product in Japan Collategene^® Intramuscular Injection. Digestive Diseases and Sciences. 2019; 34 (4): 305-308. DOI: https://doi.org/10.2745/dds.34.305

39. Banfi A., von Degenfeld G., Blau H.M. Critical role of microenvironmental factors in angiogenesis. Current Atherosclerosis Reports. 2005; 7 (3): 227-234. DOI: https://doi.org/10.1007/s11883-005-0011-7

40. Everts P., Onishi K., Jayaram P., et al. Platelet-Rich Plasma: New Performance Understandings and Therapeutic Considerations in 2020. International Journal of Molecular Sciences. 2020; 21 (20): 7794. DOI: https://doi.org/10.3390/ijms21207794

41. Ma L., Elliott S.N., Cirino G., et al. Platelets modulate gastric ulcer healing: role of endostatin and vascular endothelial growth factor release. Proceedings of the National Academy of Sciences. 2001; 98 (11): 6470-6475. DOI: https://doi.org/10.1073/pnas.111150798

42. Hendow E.K., Day R.M. A facile approach to therapeutic angiogenesis using a platelet concentrate and microsphere composite. Nano Select. 2022; 3: 1042-1047. DOI: https://doi.org/10.1002/nano.202100273

43. Lopez J., Huttala O., Sarkanen J-R., et al. Cytokine-Rich Adipose Tissue Extract Production from Water-Assisted Lipoaspirate: Methodology for Clinical Use. Biores Open Access. 2016; 5 (1): 269-278. DOI: https://doi.org/10.1089/biores.2016.0030

44. Duan H-F., Wu C-T., Wu D-L., et al. Treatment of myocardial ischemia with bone marrow-derived mesenchymal stem cells overexpressing hepatocyte growth factor. Molecular Therapy. 2003; 8 (3): 467-474. DOI: https://doi.org/10.1016/s1525-0016(03)00186-2

45. Gorecka J., Kostiuk V., Fereydooni A., et al. The potential and limitations of induced pluripotent stem cells to achieve wound healing. Stem Cell Research & Therapy. 2019; 10: 87. DOI: https://doi.org/10.1186/s13287-019-1185-1

46. Chambers S.E.J., Pathak V., Pedrini E., et al. Current concepts on endothelial stem cells definition, location, and markers. STEM CELLS Translational Medicine. 2021; 10 (Suppl 2): S54-S61. DOI: https://doi.org/10.1002/sctm.21-0022

47. Salter B., Sehmi R. The role of bone marrow-derived endothelial progenitor cells and angiogenic responses in chronic obstructive pulmonary disease. Journal of Thoracic Disease. 2017; 9 (7): 2168-2177. DOI: https://doi.org/10.21037/jtd.2017.07.56

48. Franz R.W., Parks A., Shah K.J., et al. Use of autologous bone marrow mononuclear cell implantation therapy as a limb salvage procedure in patients with severe peripheral arterial disease. Journal of Vascular Surgery. 2009; 50 (6): 1378-1390. DOI: https://doi.org/10.1016/j.jvs.2009.07.113

49. Chamberlain G., Fox J., Ashton B., Middleton J. Concise review: mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing. Stem Cells. 2007; 25 (11): 2739-2749. DOI: https://doi.org/10.1634/stemcells.2007-0197

50. Zuk P.A., Zhu M., Mizuno H., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Engineering. 2001; 7 (2): 211-228. DOI: https://doi.org/10.1089/107632701300062859

51. Nakagami H., Maeda K., Morishita R., et al. Novel autologous cell therapy in ischemic limb disease through growth factor secretion by cultured adipose tissue-derived stromal cells. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 2005; 25 (12): 2542-2547. DOI: https://doi.org/10.1161/01.ATV.0000190701.92007.6d

52. Magenta A., Florio M.C., Ruggeri M., Furgiuele S. Autologous cell therapy in diabetes‑associated critical limb ischemia: From basic studies to clinical outcomes (Review). International Journal of Molecular Medicine. 2021; 48 (3): 173. DOI: https://doi.org/10.3892/ijmm.2021.5006

53. Lin K., Matsubara Y., Masuda Y., et al. Characterization of adipose tissue-derived cells isolated with the Celution system. Cytotherapy. 2008; 10 (4): 417-426. DOI: https://doi.org/10.1080/14653240801982979

54. Velagapudi P., Turagam M., Kolte D., et al. Intramyocardial autologous CD34+ cell therapy for refractory angina: A meta-analysis of randomized controlled trials. Cardiovascular Revascularization Medicine. 2019; 20 (3): 215-219. DOI: https://doi.org/10.1016/j.carrev.2018.05.018

55. Naseri M.H., Madani H., Tafti A.S.H., et al. COMPARE CPM-RMI Trial: Intramyocardial Transplantation of Autologous Bone Marrow-Derived CD133+ Cells and MNCs during CABG in Patients with Recent MI: A Phase II/III, Multicenter, Placebo-Controlled, Randomized, Double-Blind Clinical Trial. Cell Journal. 2018; 20 (2): 267-277. DOI: https://doi.org/10.22074/cellj.2018.5197

56. Lu D., Jiang Y., Deng W., et al. Long-Term Outcomes of BMMSC Compared with BMMNC for Treatment of Critical Limb Ischemia and Foot Ulcer in Patients with Diabetes. Cell Transplantation. 2019; 28 (5): 645-652. DOI: https://doi.org/10.1177/0963689719835177

57. Heldman A.W., DiFede D.L., Fishman J.E., et al. Transendocardial mesenchymal stem cells and mononuclear bone marrow cells for ischemic cardiomyopathy: the TAC-HFT randomized trial. JAMA. 2014; 311 (1): 62-73. DOI: https://doi.org/10.1001/jama.2013.282909

58. Franz R.W., Shah K.J., Pin R.H., et al. Autologous bone marrow mononuclear cell implantation therapy is an effective limb salvage strategy for patients with severe peripheral arterial disease. Journal of Vascular Surgery. 2015; 62 (3): 673-680. DOI: https://doi.org/10.1016/j.jvs.2015.02.059

59. Shimizu Y., Kondo K., Hayashida R., et al. Therapeutic angiogenesis for patients with no-option critical limb ischemia by adipose-derived regenerative cells: TACT-ADRC multicenter trial. Angiogenesis. 2022; 25 (4): 535-546. DOI: https://doi.org/10.1007/s10456-022-09844-7

60. Teraa M., Sprengers R.W., Schutgens R.E.G., et al. Effect of repetitive intra-arterial infusion of bone marrow mononuclear cells in patients with no-option limb ischemia: the randomized, double-blind, placebo-controlled Rejuvenating Endothelial Progenitor Cells via Transcutaneous Intra-arterial Supplementation (JUVENTAS) trial. Circulation. 2015; 131 (10): 851-860. DOI: https://doi.org/10.1161/CIRCULATIONAHA.114.012913

61. Qayyum A.A., Mathiasen A.B., Helqvist S., et al. Autologous adipose-derived stromal cell treatment for patients with refractory angina (MyStromalCell Trial): 3-years follow-up results. Journal of Translational Medicine. 2019; 17 (1): 360. DOI: https://doi.org/10.1186/s12967-019-2110-1

62. Zhang J., Liu X., Li H., et al. Exosomes/tricalcium phosphate combination scaffolds can enhance bone regeneration by activating the PI3K/Akt signaling pathway. Stem Cell Research & Therapy. 2016; 7 (1): 136. DOI: https://doi.org/10.1186/s13287-016-0391-3

63. Loomans C.J.M., De Koning E.J.P., Staal F.J.T., et al. Endothelial progenitor cell dysfunction in type 1 diabetes: another consequence of oxidative stress? Antioxidants & Redox Signaling. 2005; 7 (11-12): 1468-1475. DOI: https://doi.org/10.1089/ars.2005.7.1468

64. Giannotti G., Doerries C., Mocharla P.S., et al. Impaired endothelial repair capacity of early endothelial progenitor cells in prehypertension: relation to endothelial dysfunction. Hypertension. 2010; 55 (6): 1389-1397. DOI: https://doi.org/10.1161/HYPERTENSIONAHA.109.141614

65. Puissant B., Barreau C., Bourin P., et al. Immunomodulatory effect of human adipose tissue-derived adult stem cells: comparison with bone marrow mesenchymal stem cells. British Journal of Haematology. 2005; 129 (1): 118-129. DOI: https://doi.org/10.1111/j.1365-2141.2005.05409.x

66. Hare J.M., Traverse J.H., Henry T.D., et al. A randomized, double-blind, placebo-controlled, dose-escalation study of intravenous adult human mesenchymal stem cells (prochymal) after acute myocardial infarction. Journal of the American College of Cardiology. 2009; 54 (24): 2277-2286. DOI: https://doi.org/10.1016/j.jacc.2009.06.055

67. Bartolucci J., Verdugo F.J., González P.L., et al. Safety and Efficacy of the Intravenous Infusion of Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells in Patients With Heart Failure: A Phase 1/2 Randomized Controlled Trial (RIMECARD Trial [Randomized Clinical Trial of Intravenous Infusion Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells on Cardiopathy]). Circulation Research. 2017; 121 (10): 1192-1204. DOI: https://doi.org/10.1161/CIRCRESAHA.117.310712

68. Van Nguyen T-T., Vu N.B., Van Pham P. Mesenchymal Stem Cell Transplantation for Ischemic Diseases: Mechanisms and Challenges. Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 2021; 18 (4): 587-611. DOI: https://doi.org/10.1007/s13770-021-00334-3

69. Elshaer S.L., Bahram S.H., Rajashekar P., et al. Modulation of Mesenchymal Stem Cells for Enhanced Therapeutic Utility in Ischemic Vascular Diseases. International Journal of Molecular Sciences. 2021; 23 (1): 249. DOI: https://doi.org/10.3390/ijms23010249

70. Zimta A-A., Baru O., Badea M., et al. The Role of Angiogenesis and Pro-Angiogenic Exosomes in Regenerative Dentistry. International Journal of Molecular Sciences. 2019; 20 (2): 406. DOI: https://doi.org/10.3390/ijms20020406

71. Alonso-Alonso M.L., García-Posadas L., Diebold Y. Extracellular Vesicles from Human Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells: A Review of Common Cargos. Stem Cell Reviews and Reports. 2022; 18 (3): 854-901. DOI: https://doi.org/10.1007/s12015-021-10155-5

72. Ju C., Shen Y., Ma G., et al. Transplantation of Cardiac Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes Promotes Repair in Ischemic Myocardium. Journal of Cardiovascular Translational Research. 2018; 11 (5): 420-428. DOI: https://doi.org/10.1007/s12265-018-9822-0

73. Gonzalez-King H., García N.A., Ontoria-Oviedo I., et al. Hypoxia Inducible Factor-1α Potentiates Jagged 1-Mediated Angiogenesis by Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes. 2017; Stem Cells. 35 (7): 1747-1759. DOI: https://doi.org/10.1002/stem.2618

74. Yáñez-Mó M., Siljander PR-M., Andreu Z., et al. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. Journal of Extracellular Vesicles. 2015; 4: 27066. DOI: https://doi.org/10.3402/jev.v4.27066

75. Forrester J.S., Libby P. The Inflammation Hypothesis and Its Potential Relevance to Statin Therapy. American Journal of Cardiology. 2007; 99 (5): 732-738. DOI: https://doi.org/10.1016/j.amjcard.2006.09.125

76. Yusoff F.M., Nakashima A., Kawano K., et al. Implantation of Hypoxia-Induced Mesenchymal Stem Cell Advances Therapeutic Angiogenesis. Stem Cells International. 2022; 2022: 1-14. DOI: https://doi.org/10.1155/2022/6795274

77. Ferro F., Spelat R., Shaw G., et al. Survival/Adaptation of Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells After Long-Term Starvation Through Selective Processes. Stem Cells. 2019; 37 (6): 813-827. DOI: https://doi.org/10.1002/stem.2998

78. Brezina R., Schramek S., Kazár J. Selection of chlortetracycline-resistant strain of Coxiella burnetii. Acta Virologica. 1975; 19 (6): 496.

79. Poole-Wilson P.A., Langer G.A. Effect of pH on ionic exchange and function in rat and rabbit myocardium. American Journal of Physiology. 1975; 229 (3): 570-581. DOI: https://doi.org/10.1152/ajplegacy.1975.229.3.570

80. Bian X., Ma K., Zhang C., Fu X. Therapeutic angiogenesis using stem cell-derived extracellular vesicles: an emerging approach for treatment of ischemic diseases. Stem Cell Research & Therapy. 2019; 10: 158. DOI: https://doi.org/10.1186/s13287-019-1276-z